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1、變性

90～94℃的高溫處理可使模板 DNA 雙鏈間氫鍵斷裂,解離成單鏈但不改變其化學(xué)性質(zhì),變性的時間一般為30s,如果模板的 G+C 含量較高,變性時間可能延長。

2、退火

退火的溫度一般降低至25～65℃。在退火過程中,引物分別與待擴(kuò)增的 DNA 片段的兩條鏈的3'端互補(bǔ)配對。退火的溫度取決于引物的 T_m 值,并通過預(yù)備試驗(yàn)來最后確定。一般引物越短,其 T_m 也越低,對于10bp 左右的隨機(jī)引物,退火溫度在37℃左右,反之則高。退火溫度越高,引物與模板結(jié)合的特異性增強(qiáng),非特異性的擴(kuò)增概率降低,但擴(kuò)增效率也隨之降低。相反,隨著溫度的降低,引物與模板非特異性結(jié)合的概率提高。引物的長度越長,其退火溫度則越高,否則會發(fā)生非特異性結(jié)合,降低 PCR 產(chǎn)物對模板的忠實(shí)程度。退火時間一般為30s。

3、延伸

Taq DNA 聚合酶的最適溫度為70～74℃,在此溫度下 Taq DNA 聚合酶以單鏈 DNA 鏈為模板,將單核苷酸逐個加入到引物的3'端,使引物不斷延長,從而合成新的 DNA 鏈。新合成的引物延伸鏈在下一輪循環(huán)時就可以作為模板。反應(yīng)步驟的溫度和時間可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求自行設(shè)定,一般要經(jīng)過20～30個循環(huán),擴(kuò)增產(chǎn)物需要經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。